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发表于 2010-9-14 15:24:01
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本帖最后由 海内知己 于 2010-9-14 16:35 编辑
附件1
病原学检测方法
(厚血膜法)
一、血片制作
于晚9时至翌晨2时,以皮肤消毒剂消毒耳垂(或指端)待干,用一次性采血针快速深刺,取血6大滴,约等于120μl,涂于2张玻片,制成边缘整齐、厚薄均匀的椭圆形厚血膜(约长3cm、宽1.5cm),平放于有盖的玻片盒内。
二、血片染色
将经自然干燥的血片放入清水中溶血5分钟~10分钟,至血膜呈乳白色,取出晾干,用甲醇固定,染色。大规模普查可用硼砂美蓝染色,鉴定虫种或保存标本宜用吉氏液或苏木素染色。
(一)硼砂美蓝染色法。取美蓝2g,硼砂3g,置研钵内,边研边加水,待溶解后冲洗入瓶中,加蒸馏水100ml配成原液,过滤后放置备用。染色时取原液5ml加清水配成5%稀释液,染3分钟~5分钟,使血膜呈天蓝色,然后用清水轻轻冲洗。本法染色前可不必先溶血、固定。
(二)吉氏染色法。染液由吉氏粉0.5g,中性甘油25ml及甲醇25ml配成。先置染粉于研钵内,加少量甘油充分研磨,边研边加,至甘油加完为止,然后移入带玻璃塞的100ml玻塞瓶内,用甲醇小量多次洗涤甘油染液移入瓶内,盖紧瓶盖,充分摇匀,置于55℃—60℃温箱内24小时或室温下3天—5天,即为原液,放置愈久染色效果愈佳,临用时稀释。将溶血后已干的血片用甲醇固定约1分钟,然后滴加10%染液(原液加清水稀释配成)染色45分钟,用蒸馏水轻轻冲洗。
(三)德氏苏木素染色法。染液由A液即铵明矾饱和液(铵明钒20g、蒸馏水100ml)、B液(苏木素结晶1g加纯酒精10ml)、C液(甘油25ml加甲醇25ml)配成。将B液逐滴加入A液中,倒入一不盖紧的容器内,置于空气流通处,经2周至1个月使其充分氧化,过滤后加入C液,密封备用。血片溶血、固定步骤同前。用上述染液染色10分钟~20分钟,用0.05%—0.1%稀盐酸脱色片刻,流水冲洗至血膜呈蓝色。
三、血片镜检
将染色的血片在低倍显微镜下顺序逐个视野检查微丝蚴并计数,根据微丝蚴的大小、体态、折光性、有无鞘膜、表皮是否光滑及内部结构等特征,予以确定。在高倍镜下观察微丝蚴的体核及头端空隙、神经环、排泄细胞、排泄孔、肛孔、尾核等结构,以鉴别班氏和马来微丝蚴。必要时用油镜作进一步鉴别。
四、班氏与马来微丝蚴形态鉴别要点
特 征
班氏微丝蚴
马来微丝蚴
长度(μm)
244~296(平均260)
177~230(平均220)
宽度(μm)
5.3~7.0
5.0~6.0
体态
柔和,弯曲自然,无小弯
僵直,大弯上有小弯
头端空隙(长宽比)
较短(1 :1)
较长(2 :1)
体核
圆形,排列整齐,各核分开,清晰可数
卵圆形,大小不等,排列紧密,常相互重叠,不易分清
尾核
无
2个
附件2
血清学检测方法
一、快速免疫色谱试验(ICT)检测班氏丝虫抗原
(一)试剂盒内容物(置4℃可保存6个月):含测试卡和100µl刻度毛细管。
(二)血样:全血100µl。
(三)操作步骤。
1.打开测试卡, 移去并丢弃粘胶衬里, 确保卡的右手边缘粘胶是暴露的。
2.利用毛细管的虹吸作用,从耳垂或手指取血,使毛细管内血量吸至100µl刻度线。
3.将100µl全血从毛细管加到测试卡粉红色和白色垫的顶部。注意每一滴血完全吸收后再加第2滴。如毛细管内的血滴出不畅,可将管尖轻按垫子。
4.等垫子的粉红色部分完全浸透血清(约需30秒~1分钟)后关闭测试卡。如在1分钟~2分钟垫子的粉红色部分仍未能浸透血清,应加1滴试剂。用力压紧测试卡视窗右边区域,并开始计时。
(四)结果判断标准。
关闭测试卡2分钟后,通过测试卡视窗读结果。若在视窗内见到2条线(对照线和测试线),则结果为阳性;如只有对照线显示,则结果为阴性。如是弱阳性血样,可延长显示时间至关闭测试卡15分钟时再做记录,以确定结果。如果对照线不显示,则测试无效,应当重新进行测试。读卡时间最长限在15分钟,长时间放置,阴性多会变成阳性。
注:ICT测试卡不适用于检测马来丝虫病。
二、ELISA检测丝虫特异IgG4抗体试验
(一)试剂盒内容物(置4℃可保存6个月):含丝虫抗原包被板、抗人IgG4酶结合物、洗涤剂干粉、底物稀释液、底物干粉、反应终止液、阴性对照、阳性对照。
(二)血样(血清或滤纸血)
1.血清:采集受检者的静脉血或末梢血,离心后收集血清。在低温下运送,4℃保存,–20℃可长期保存。
2.滤纸血:以洁净滤纸沾取自然流出的一滴耳垂或手指血(约20µl),血斑直径应在1.1 cm~1.2cm,厚薄均匀。自然干燥后密封置4℃保存(可保存约6个月)。
(三)操作步骤。
1.将每袋洗涤剂干粉用500ml蒸馏水溶解作反应板洗涤液和样品稀释液用。血清样本按1:40稀释,滤纸血样本按直径1.1cm圆片加400µl样本稀释液,37℃浸泡2小时(或4℃过夜)稀释处理。
2.取已稀释的样本100µl加入反应板孔内,同时设阴性、阳性对照(阴、阳性对照已稀释,直接加入100µl)及空白对照(加100µl样本稀释液)各1孔,37℃反应90分钟后甩去孔内液体,用洗涤液加满各孔,静置30秒后甩去,共洗5次,最后一次拍干。
3.除空白对照孔外每孔加抗人IgG4酶结合物2滴,37℃反应90分钟后甩干孔内液体。同上洗涤。
4.将底物干粉完全溶解于底物稀释液中(底物溶解后4℃避光可保存1周),各孔加入底物溶液2滴,37℃30分钟后加1滴终止液终止反应,混匀,观察结果。
(四)结果判断标准
1.肉眼观察:当阴性对照孔无色或显微黄色,阳性对照孔呈明显黄色时,试验有效。待检样品孔颜色呈明显深于阴性对照的黄色即判为阳性。
2.仪器检测:应用酶标仪以空白对照孔调零,在波长405nm处读取各孔OD值。以样本OD≥阴性对照OD值的2.1倍为阳性,若阴性对照OD值不足0.07,按0.07计算。
注:IgG4抗体试验适用于检测班氏丝虫和马来丝虫病。
附件3
丝虫病个案调查表
一、一般情况
姓名: ;性别: ;出生年月: 年 月。
固定电话: ;手机: 。
现住址:
省 市 县(市、区) 乡(镇/街道) 行政村(居委会) 自然村。
原居住地: 省 市 县(市、区) 乡(镇/街道) 行政 村(居委会) 自然村。
原居住地是否有丝虫病的流行?是=1,不是=2,不清楚=3。
近年服务单位: ;单位电话: ;联系人: 。
曾去过的国家或地区: ,1.外出时间:
年 月 日 至 年 月 日。2.外出时间: 年 月 日 至 年 月 日。
二、是否做过微丝蚴检查: 查过=1,未查过=2,记不清=3。
如果查过: 最后一次的检查时间是:
年
月。
检查的结果是: 阳性=1,阴性=2,记不清=3。
三、是否服用过乙胺嗪:服过=1, 未服过=2, 记不清=3。
四、近一年中,是否有以下症状或体征(可多选):
急性淋巴管/淋巴结炎=1,淋巴水肿/象皮肿=2,乳糜尿=3,鞘膜积液=4,无=5。
五、此次病原学检查时间:
年
月 日 。
病原学检查结果:班氏丝虫=1,马来丝虫=2;阴性=3。
微丝蚴密度: 条/120µl。
调查人:
调查时间: 年 月 日
附件4
蚊媒分类调查表
省
县(市、区)乡(镇/街道) 行政村(居委会) 自然村
捕蚊日期
中华按蚊(只)
嗜人按蚊(只)
淡色库蚊(只)
致倦库蚊(只)
其他蚊种(只)
捕蚊者
日期: 年 月 日
鉴定者
日期: 年 月 日
附件5
蚊媒幼丝虫自然感染调查表
省 县(市、区)乡(镇/街道) 行政村(居委会) 自然村
阳性蚊序号
捕蚊日期
阳性蚊幼丝虫解剖结果
备注
中华按蚊
嗜人按蚊
淡色库蚊
致倦库蚊
腊肠期条数
感染前期条数
感染期条数
腊肠期条数
感染前期条数
感染期条数
腊肠期条数
感染前期条数
感染期条数
腊肠期条数
感染前期条数
感染期条数
1
2
3
4
5
6
7
8
…
捕蚊者 日期: 年 月 日
鉴定者 日期: 年 月 日
解剖者 日期: 年 月 日
镜检者 日期: 年 月 日
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