纳尼，磷霉素也要被耐药了吗？

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检索丨徐娅娟
翻译丨徐娅娟
审核丨周玲米






编者按 耐万古霉素的肠球菌（VRE）为多重耐药菌，常可导致医院内菌血症，感染性心内膜炎以及难以治疗的腹内和尿道感染。磷霉素是一种抗菌药物，对肠球菌，葡萄球菌和许多革兰氏阴性菌显示出广泛的活性。由于磷霉素的结构及作用位点与其他常用的抗生素有很大的差别，在当前耐药菌感染日益严重的情况下，磷霉素在抗耐药菌感染中受到越来越多的关注，但随着磷霉素在临床上的广泛应用，耐药性也逐渐显现，请跟着本研究对磷霉素的耐药现状及对耐药机制进行初步了解和探讨。


耐万古霉素屎肠球菌中磷霉素的高水平耐药
背景
磷霉素的杀菌机制
磷霉素与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)结构相似，因此能代替PEP与尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺-3-烯醇式丙酮酸转移酶(MurA酶)活性中心进行不可逆的共价结合，使MurA失活，而MurAl酶能催化细菌细胞壁合成的第一步反应，即将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)加到UDP -N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc) 的3’-OH端合成UDP -N-乙酰葡糖胺丙酮酸盐，，MurA失活后，细菌细胞壁的合成停滞，从而呈现杀菌作用。


靶酶MurA突变可引起磷霉素耐药
某些细菌如伯氏疏螺旋体和结核分枝杆菌对磷霉素具有天然抗性，因为它们在MurA的磷霉素结合位点编码天冬氨酸而不是半胱氨酸。另外，某些大肠杆菌的MurA活性位点Cys115突变为Asp115或Glu115时，则MurA酶失去活性，对磷霉素产生耐药性。


方法

2012 - 2016年期间，我们在匹兹堡大学医学中心（匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）对直肠筛选培养获得的VRE分离株的磷霉素抗性进行研究。890个VRE分离株在含有100或200μg/ mL磷霉素和25μg/ mL葡萄糖-6-磷酸的Mueller-Hinton琼脂平板上进行培养，在两个选择性平板上生长的分离株再通过使用琼脂稀释法在补充有25μg/ mL葡萄糖-6-磷酸（6）的Mueller-Hinton琼脂平板上进行MIC的测定。


结果

在含有磷霉素的选择性平板上生长的234株分离株中，MIC为32μg/ mL为10株，64μg/ mL为92株，128μg/ mL为120株，256μg/ mL为7株，512μg/ mL为1株，>1024μg/ mL为4株。
MIC> 1024μg/ mL的4株VRE分离株均为屎肠球菌。我们通过使用NextSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）将这些分离株和磷霉素敏感的屎肠球菌标准分离株进行高通量配对末端测序，并在GenBank中保存组装的基因组序列（SAMN07274321-5）。


研究发现4个耐磷霉素分离株的murA基因在核苷酸位置355-357处的密码子由TGT Cys119 变化为GAT Asp119，且磷霉素敏感的对照标准株或所有屎肠球菌基因组序列中不存在该突变，并通过Sanger测序进一步证实。其他8个MIC为256或512μg/ mL耐磷霉素分离株的murA基因也不含有对应于C119D的非同义突变。因此，C119D突变对磷霉素MIC>1024μg/ mL的分离株是特异性的。


我们对murA的野生型和突变体（C119D）进行PCR扩增，并将它们克隆到pTCV- lac穿梭表达载体上，确认序列后，我们将重组质粒转化到大肠杆菌 SM10中，随后将它们转移到屎肠球菌D344S中。pTCV-lac- murA C119D的导入产生了> 1024μg / mL的更高的MIC，与murA WT对照相比MIC增加了> 4倍。这一发现表明C119D MurA更不易被磷霉素结合失活。


我们计算了重组纯化的野生型和C119D MurA的米氏常数（表1）。与野生型酶相比（K m 382.8±79.5μmol/ L; p = 0.02），MurA中的C119D取代增加了UDP-N-乙酰葡糖胺的米氏常数K m的平均值±SD（K m803.2±180.0μmol/ L），但不影响酶的催化能力（k cat）。K m的这种增加导致对于UDP-N-乙酰葡糖胺C119D MurA催化效率（k cat / K m））降低约2倍。但是，C119D对PEP的动力学参数没有明显影响。


磷霉素对野生型MurA50％抑制浓度的平均±SD为176.8±38.3 nmol / L; 在浓度< 100μmol/ L磷霉素时，没有观察到对C119D MurA的抑制（图1）。
结论
在本研究中，磷霉素保持了对大多数VRE分离株的活性，但是我们发现MurA中活性部位半胱氨酸被替代引起的磷霉素高水平耐药，伴随MurA催化活性的轻度降低，造成这些动力学活性差异的原因尚不清楚，需要额外的结构功能研究来阐明这些MurA蛋白之间的差异。


表1 耐万古霉素肠球菌WT和C119D MurA的米氏常数



注：MurA，UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酰转移酶; NS，不显著; PEP，磷酸烯醇式丙酮酸; UNAG，UDP-N-乙酰葡糖胺; WT，野生型。







图1  磷霉素对重组纯化的万古霉素耐药屎肠球菌野生型（A）和C119D（B）MurA活性的抑制


参考文献：Guo Y, Tomich A D, Mcelheny C L, et al. High-Level Fosfomycin Resistance in Vancomycin-ResistantEnterococcus faecium:[J]. Emerging Infectious Diseases, 2017, 23(11):1902-1904.


图文编辑：春虾